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動脈粥樣硬化與衰老密切相關(guān)，是全球主要的死亡原因之一。越來越多的證據(jù)表明，血管平滑肌細胞（VSMC）的衰老在動脈粥樣硬化的形成中發(fā)揮重要作用。
VSMC的衰老不僅導(dǎo)致其數(shù)量減少，還影響了斑塊破裂后的修復(fù)能力，進而增加斑塊的脆弱性。因此，深入探討VSMC衰老的新機制并尋找新的治療靶點是推動動脈粥樣硬化治療的重要方向。
細胞衰老通常是由多種因素引發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細胞不可逆地停止生長。衰老細胞會釋放出多種生物活性物質(zhì)，稱為衰老相關(guān)分泌表型（SASP），這些物質(zhì)破壞了組織微環(huán)境，并引發(fā)衰老相關(guān)的炎癥反應(yīng)。關(guān)于SASP在VSMC衰老及動脈粥樣硬化中的表觀遺傳調(diào)控仍存在明顯的研究空白。
衰老的VSMC經(jīng)歷了從線粒體氧化磷酸化到有氧糖酵解的代謝轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變導(dǎo)致乳酸的積累。乳酸不僅是能量代謝的重要調(diào)節(jié)劑，其過高的水平還被認為與多種疾病的發(fā)展相關(guān)。因此，揭示乳酸及其代謝產(chǎn)物對衰老和動脈粥樣硬化的影響，將為理解這一疾病提供新視角。
腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白1（TRAP1）是熱休克蛋白家族的重要成員，參與細胞的代謝和穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。已有研究表明，線粒體基因TRAP1在調(diào)控乳酸積累方面發(fā)揮著作用，并與衰老相關(guān)疾病密切相關(guān)，但其在動脈粥樣硬化中的具體功能尚未被充分探索。
本研究全面探討TRAP1在VSMC衰老和動脈粥樣硬化中的作用。研究證明HDAC3是調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞（VSMC）衰老中H4K12la的重要因子，促進SASP表達并加速細胞衰老，同時闡明了能量代謝與表觀遺傳功能的聯(lián)系，為衰老相關(guān)疾?。ㄈ鐒用}粥樣硬化）的治療提供了新見解與策略。
相關(guān)研究由南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院團隊于2024年8月1日發(fā)表在心血管頂級期刊European Heart Journal (歐洲心臟病學(xué)雜志，IF=37.6) 。具體研究思路解析如下：
研究目標：旨在探討線粒體基因TRAP1在血管平滑肌細胞（VSMC）衰老中的作用，特別是在動脈粥樣硬化和高脂飲食條件下TRAP1的表達如何影響細胞衰老過程。
方法步驟：
（1）數(shù)據(jù)庫整合與基因篩選：研究者整合了衰老相關(guān)數(shù)據(jù)庫和MitoMiner數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)在Ras誘導(dǎo)的人VSMC中TRAP1顯著上調(diào)，提示其可能與衰老相關(guān)。
（2）樣本分析：對動脈粥樣硬化患者和高脂飲食喂養(yǎng)的ApoeKO小鼠的主動脈組織進行分析，結(jié)果顯示TRAP1及衰老標志物（如P53、P21、P16）的表達水平升高，表明TRAP1與VSMC衰老相關(guān)。
（3）免疫熒光染色：通過免疫熒光染色觀察TRAP1與血管平滑肌細胞標記物α-SMA的共定位，進一步確認TRAP1在動脈粥樣硬化斑塊中的表達。
（4）TRAP1敲低：進行TRAP1敲低實驗，發(fā)現(xiàn)TRAP1的缺失可以顯著降低Ras誘導(dǎo)的衰老標志物，并改善線粒體功能和能量代謝。
（5）TRAP1過表達：過表達TRAP1的細胞實驗顯示，TRAP1過表達會顯著促進VSMC的衰老，提示TRAP1在細胞衰老中的促效應(yīng)。
（6）衰老特征評估：評估VSMC衰老的特征，包括表型轉(zhuǎn)變（收縮表型相關(guān)基因表達下降，合成表型相關(guān)基因表達上升）、SA-β-Gal陽性細胞的數(shù)量以及細胞增殖能力的變化。
（7）SASP分析：研究TRAP1對衰老相關(guān)分泌表型（SASP）的影響，發(fā)現(xiàn)TRAP1沉默顯著降低了SASP的上調(diào)。
結(jié)果總結(jié)：證實TRAP1作為一種與衰老相關(guān)的線粒體基因，對VSMC的衰老具有積極促進作用。TRAP1的表達水平與動脈粥樣硬化和細胞衰老密切相關(guān)，其缺失可改善線粒體功能并延緩衰老過程，而過表達則加速衰老。這些發(fā)現(xiàn)為理解細胞衰老機制提供了新的視角，并可能為相關(guān)疾病的治療提供潛在的靶點。
圖1 TRAP1調(diào)節(jié)VSMC衰老
研究目標：探索TRAP1在Ras誘導(dǎo)的人血管平滑肌細胞（VSMC）中的作用，特別是其如何影響線粒體功能和能量代謝。
實驗設(shè)計：
（1）缺失TRAP1的影響：比較TRAP1缺失與正常情況對于線粒體損傷及代謝變化的影響，采用線粒體染色與Seahorse實驗測定線粒體功能和糖酵解活性。
（2）代謝產(chǎn)物的檢測：評估缺失TRAP1后，乙酰輔酶A和檸檬酸的水平，分析能量代謝的轉(zhuǎn)變趨勢。
（3）關(guān)鍵酶的表達檢測：
通過Western blot和qPCR檢測糖酵解限速酶（如PFK1、HK2、PKM2）以及參與三羧酸循環(huán)（TCA）和電子傳遞鏈的酶的表達與活性。觀察TRAP1缺失是否上調(diào)PFK1的表達，并分析這種變化對其他代謝途徑的影響。
（4）相互作用分析：
使用共免疫沉淀（CoIP）等技術(shù)驗證TRAP1與PFK1之間的相互作用。檢測TRAP1對PFK1泛素化水平的影響，分析其如何通過降低泛素化促進PFK1表達。
（5）干預(yù)實驗：
通過使用TRAP1抑制劑G-TPP和小干擾RNA（siRNA）靶向TRAP1，觀察對VSMC代謝的影響。檢測PFK1抑制劑對TRAP1過表達VSMC中線粒體功能的改善作用。
結(jié)果分析：TRAP1缺失能改善Ras誘導(dǎo)的VSMC線粒體損傷，減少能量代謝對糖酵解的傾斜，同時提高氧化磷酸化水平。PFK1的過表達對電子傳遞鏈的活性產(chǎn)生抑制作用，TRAP1通過與PFK1相互作用，在調(diào)節(jié)糖酵解途徑上發(fā)揮關(guān)鍵作用。
結(jié)論：TRAP1通過上調(diào)PFK1的表達，抑制TCA循環(huán)和電子傳遞鏈活性，從而影響VSMC的能量代謝。這一發(fā)現(xiàn)強調(diào)了TRAP1在衰老和動脈粥樣硬化中的重要角色，為未來治療策略的開發(fā)提供了新的視角。
圖2 TRAP1是衰老VSMC中能量重編程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子
研究背景：研究關(guān)注TRAP1在衰老人血管平滑肌細胞（VSMC）中對乳酸生產(chǎn)的影響，以及乳酸在細胞衰老中的作用。
實驗?zāi)繕耍?/span>
（1）確定TRAP1敲低對VSMC中乳酸水平的影響。
（2）測試外源性補充乳酸是否能夠逆轉(zhuǎn)TRAP1敲低所引起的細胞衰老。
實驗設(shè)計：
（1）TRAP1敲低：通過小干擾RNA（siRNA）靶向TRAP1，觀察衰老VSMC中的乳酸產(chǎn)量變化，使用Seahorse實驗測定細胞的代謝功能，并通過Western blot（WB）和SA-β-Gal染色來評估細胞衰老和相關(guān)標志物的表達。
（2）外源性乳酸補充：在TRAP1敲低后補充外源性乳酸，檢測其對細胞衰老指標的影響。
（3）乳酸抑制實驗：使用糖酵解抑制劑2-DG、乳酸脫氫酶抑制劑和針對乳酸脫氫酶的siRNA來降低乳酸產(chǎn)生，觀察這些處理對VSMC衰老的影響。
結(jié)果分析：
（1）發(fā)現(xiàn)TRAP1敲低確實降低了衰老VSMC中的乳酸產(chǎn)量，同時補充乳酸可以逆轉(zhuǎn)TRAP1敲低引起的衰老現(xiàn)象，包括衰老標志物的減少和細胞增殖能力的提升。
（2）糖酵解抑制劑和乳酸脫氫酶的抑制也顯著降低了乳酸水平，并減輕了VSMC的衰老表現(xiàn)，進一步支持乳酸積累與TRAP1誘導(dǎo)衰老之間的關(guān)系。
結(jié)論：研究結(jié)果支持TRAP1通過增加乳酸積累來促進VSMC衰老的假設(shè)，說明乳酸作為關(guān)鍵代謝物在細胞衰老中的重要性。
圖3 TRAP1介導(dǎo)的乳酸積累促進VSMC衰老
研究背景：本研究探討TRAP1介導(dǎo)的乳酸積累如何通過組蛋白H4K12乳酸化（H4K12la）促進衰老的血管平滑肌細胞（VSMC）中衰老相關(guān)分泌表型（SASP）的激活。
實驗設(shè)計：
（1）TRAP1敲低：通過敲低TRAP1，觀察Ras誘導(dǎo)的人VSMCs中整體蛋白乳酸化（特別是H4K12la）水平的變化，主要借助Western blot分析。
（2）H4K12la定位：使用超分辨率熒光成像觀察H4K12la在衰老VSMCs中的定位，尤其是在核膜的富集情況。
（3）外源乳酸補充：補充乳酸以檢測其是否能恢復(fù)TRAP1敲低后H4K12la水平的變化。
（4）驗證H4K12la與SASP的關(guān)系：
通過ChIP-qPCR和核跑膠實驗確認H4K12la在SASP啟動子區(qū)域的富集，進而分析H4K12la對SASP轉(zhuǎn)錄的影響。
（5）HDAC3的作用：
研究HDAC3在調(diào)節(jié)H4K12la和SASP中的作用，評估p300和HDAC1-3的催化功能，特別觀察HDAC3在Ras誘導(dǎo)的hVSMC中的表達變化。驗證乳酸如何影響HDAC3的表達，并通過Western blot和免疫熒光染色確認其對H4K12la水平的影響。
（6）干預(yù)實驗：
過表達HDAC3以評估其對H4K12la、衰老標志物和SASP表達的影響，使用轉(zhuǎn)錄技術(shù)檢測新生SASP轉(zhuǎn)錄物的變化。
（7）HDAC激動劑的實驗：
使用HDAC激動劑ITSA-1進一步驗證HDAC3在H4K12la介導(dǎo)的衰老中的作用，觀察其對H4K12la和SASP轉(zhuǎn)錄的影響。
研究結(jié)論：乳酸通過下調(diào)HDAC3表達，增加H4K12la水平，進而促進VSMC的衰老和SASP的激活。這一機制提供了TRAP1在細胞衰老中的新見解，強調(diào)了乳酸和表觀遺傳修飾在衰老過程中的重要性。
圖4 TRAP1介導(dǎo)H4K12la促進衰老VSMC中SASP激活
本研究旨在探討HDAC3在Ras誘導(dǎo)的衰老VSMCs中的作用，以及乳酸如何通過調(diào)節(jié)HDAC3表達來影響VSMC衰老和SASP（衰老相關(guān)分泌表型）的表達。
實驗?zāi)繕耍?/span>
確定Ras誘導(dǎo)的VSMCs中HDAC3的表達變化。
探究TRAP1敲低或乳酸如何影響HDAC3的表達。
評估HDAC3過表達對VSMC衰老及SASP表達的影響。
驗證HDAC3激動劑ITSA-1在抑制H4K12乳酸化和衰老方面的作用。
實驗設(shè)計：
Western blot分析：檢測Ras誘導(dǎo)的VSMCs中HDAC3的表達變化。過表達實驗：通過過表達HDAC3來觀察其對VSMC衰老及SASP表達的影響。
抑制劑實驗：使用HDAC3激動劑ITSA-1來驗證其對H4K12乳酸化和衰老的影響。
染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗：檢測H4K12乳酸化在SASP啟動子處的富集情況。
關(guān)鍵步驟：
HDAC3表達檢測：通過Western blot分析發(fā)現(xiàn)Ras誘導(dǎo)的VSMCs中HDAC3蛋白表達顯著下調(diào)。
TRAP1和乳酸的影響：TRAP1敲低或添加乳酸可以進一步下HDAC3的表達
HDAC3過表達實驗：通過過表達HDAC3，發(fā)現(xiàn)其可以顯著減H4K12乳酸化，降低衰老標志物和SASP的表達，恢復(fù)細胞增殖能力。
HDAC3激動劑實驗：使用HDAC3激動劑ITSA-1可以有效防止H4K12乳酸化和衰老的增加。
ChIP實驗：驗證HDAC3過表達對SASP啟動子處H4K12乳酸化和相關(guān)組蛋白修飾的影響。
結(jié)果分析：
Ras誘導(dǎo)的VSMCs中HDAC3表達顯著下降。
TRAP1敲低或添加乳酸可以進一步下調(diào)HDAC3的表達。
HDAC3過表達可以顯著減少H4K12乳酸化，降低衰老標志物和SASP的表達，恢復(fù)細胞增殖能力。
HDAC3激動劑ITSA-1可以有效防止H4K12乳酸化和衰老的增加。
ChIP實驗顯示，HDAC3過表達顯著降低SASP啟動子處H4K12乳酸化和相關(guān)組蛋白修飾的水平。
結(jié)論：
（1）乳酸通過抑制HDAC3的表達來增加H4K12乳酸化，從而促進VSMC衰老。
（2）HDAC3的過表達可以減少H4K12乳酸化，降低衰老標志物和SASP的表達，恢復(fù)細胞增殖能力。
（3） HDAC3激動劑ITSA-1可以有效防止H4K12乳酸化和衰老的增加，支持HDAC3在VSMC衰老中的關(guān)鍵作用。
通過這些實驗，揭示了HDAC3在VSMC衰老和SASP表達中的重要作用，為治療衰老相關(guān)疾病提供了新的靶點和策略。
圖5通過阻斷 HDAC3 上調(diào) H4K12la 可促進 VSMC 衰老
研究目標：探索SMC特異性TRAP1敲除在高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)的Apoe KO小鼠中對主動脈動脈粥樣硬化（AS）的影響，包括斑塊面積、穩(wěn)定性、衰老VSMC數(shù)量、H4K12乳酸化、能量代謝和SASP表達等。
實驗設(shè)計：
小鼠模型：使用Apoe KO小鼠建立SMC特異性Trap1敲除小鼠（Apoe KO Trap1 SMCKO），并喂養(yǎng)它們正常飼料（NC）或高脂飲食（HFD），持續(xù)16周。
斑塊分析：采用Oil Red O染色觀察主動脈中的脂質(zhì)斑塊面積和穩(wěn)定性，通過免疫組織化學(xué)染色進一步評估斑塊的穩(wěn)定性。
衰老和能量代謝檢查：通過免疫熒光染色和Western blot分析衰老標志物（如P21）和H4K12乳酸化的表達，同時評估SASP因子和細胞能量代謝的變化。
關(guān)鍵步驟：
斑塊面積測定：比較HFD喂養(yǎng)的Apoe KO Trap1 WT與Trap1 SMCKO小鼠，觀察主動脈斑塊面積的變化。
衰老及乳酸化水平評估：使用P21和α-SMA的免疫熒光染色確認VSMC衰老，同時檢測H4K12乳酸化水平。
分化狀態(tài)及表型分析：評估在HFD喂養(yǎng)下VSMC的收縮表型與合成表型基因的表達變化。
結(jié)果分析：
斑塊面積和穩(wěn)定性：發(fā)現(xiàn)Trap1敲除小鼠中的斑塊面積顯著減少，且斑塊更穩(wěn)定。
衰老VSMC的減少：Trap1 SMCKO小鼠中衰老VSMC數(shù)量減少，H4K12乳酸化水平顯著降低，表明TRAP1在VSMC衰老中扮演重要角色。
能量代謝與SASP的改善：Trap1敲除導(dǎo)致乳酸產(chǎn)生和SASP表達顯著下降，說明VSMC的能量代謝得到改善。
結(jié)論：
（1）TRAP1通過增加H4K12乳酸化來促使VSMC衰老，從而推動動脈粥樣硬化的發(fā)展。
（2）SMC特異性Trap1敲除能夠顯著降低斑塊面積、增強斑塊穩(wěn)定性，并改善VSMC的代謝狀態(tài)及衰老特征，提示TRAP1可能是動脈粥樣硬化治療的新靶點。
圖6 SMC 特異性Trap1敲除可改善動脈粥樣硬化
研究目標：探討TRAP1抑制劑G-TPP在高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)的Apoe KO小鼠中對主動脈動脈粥樣硬化（AS）發(fā)展的影響，包括斑塊面積、壞死核心大小和膠原含量的變化。
實驗設(shè)計：
小鼠模型：將HFD喂養(yǎng)的Apoe KO小鼠分為G-TPP處理組與對照組。毒性和代謝參數(shù)監(jiān)測：在給予G-TPP后，監(jiān)測小鼠的代謝參數(shù)確保不會對其代謝造成負面影響。
斑塊分析：通過油紅O染色、Masson染色、Sirius Red染色和H&E染色來評估主動脈斑塊面積、壞死核心大小及膠原含量。
衰老標志物檢測：使用免疫熒光染色和Western blot分析P21、H4K12乳酸化（H4K12la）信號和SASP因子的表達。
關(guān)鍵步驟：
斑塊和膠原分析：比較G-TPP處理組與對照組小鼠主動脈的斑塊特征，包括面積、壞死核心大小及膠原含量。
衰老與乳酸化水平測定：觀察G-TPP處理是否能顯著降低VSMC中的P21和H4K12la水平，并評估MOVAS細胞中的衰老標志物和SASP的表達。
結(jié)果分析：
斑塊改善：G-TPP處理顯著降低了HFD喂養(yǎng)的Apoe KO小鼠的主動脈斑塊面積和壞死核心大小，同時增加了膠原含量，表明動脈粥樣硬化得到了改善。
衰老標志物的變化：在G-TPP治療后，免疫熒光和Western blot分析顯示小鼠主動脈中的P21和H4K12la信號顯著降低，表明VSMC的衰老程度減輕。
SASP的降低：G-TPP處理降低了MOVAS細胞中的SASP因子的表達，進一步支持了TRAP1抑制對衰老和炎癥反應(yīng)的影響。
結(jié)論：
使用TRAP1抑制劑G-TPP可以有效減緩HFD誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化發(fā)展，通過降低斑塊尺寸、增加膠原含量及減少VSMC的衰老標志物，建立了TRAP1作為動脈粥樣硬化治療的新靶點。這些結(jié)果表明，抑制TRAP1可能是一種有前景的動脈粥樣硬化治療策略，值得在未來進行更深入的研究和臨床應(yīng)用探索。
圖7 TRAP1 的藥理學(xué)抑制可抑制體內(nèi)動脈粥樣硬化發(fā)展
研究目標：探討通過PROTAC技術(shù)降解TRAP1作為治療動脈粥樣硬化的新策略，相較于傳統(tǒng)抑制劑，靶向蛋白降解具有更高的療效和特異性。
實驗設(shè)計：
（1）候選化合物：識別小分子化合物16b（BP3），該化合物能夠促使TRAP1通過泛素化機制降解，依賴于cereblon（CRBN）。
（2）TRAP1降解實驗：通過Western blot分析評估BP3對TRAP1蛋白的降解效果，觀察在不同濃度下TRAP1的變化。
（3）評估細胞毒性：實施初步毒性評估，確認BP3在高濃度下對細胞的毒性有限，確保其應(yīng)用安全。
（4）體內(nèi)實驗：
小鼠模型：在高脂飲食（HFD）條件下對ApoeKO小鼠進行BP3治療，分析其對斑塊面積、壞死核心和膠原蛋白含量的影響。
生理參數(shù)監(jiān)測：監(jiān)測小鼠在治療前后的體重、血壓和血脂，確保BP3對這些生理參數(shù)沒有顯著影響。
實驗結(jié)果：BP3能夠有效誘導(dǎo)TRAP1的降解，顯著減少VSMC的衰老和動脈粥樣硬化的相關(guān)病變；BP3治療后，小鼠主動脈中的斑塊面積和壞死核心顯著減少，并且膠原含量增加，顯示出動脈粥樣硬化的改善；還發(fā)現(xiàn)BP3處理降低了相關(guān)衰老標志物、H4K12la和SASP的表達，體現(xiàn)出TRAP1的降解效果。
結(jié)論：通過BP3降解TRAP1，顯示出其作為動脈粥樣硬化治療的新方式的潛力。這一研究結(jié)果為未來的臨床應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)。
圖8 通過 PROTAC 降解 TRAP1 治療動脈粥樣硬化
本研究發(fā)現(xiàn)線粒體蛋白TRAP1在血管平滑肌細胞（VSMC）衰老及動脈粥樣硬化中起重要作用，誘導(dǎo)組蛋白微環(huán)境變化并促進衰老進程。
TRAP1的上調(diào)促進糖酵解，導(dǎo)致乳酸積累。積累的乳酸通過抑制組蛋白賴氨酸去乙酰化酶HDAC3，增強H4K12乳酸化（H4K12la），從而促進衰老相關(guān)分泌表型（SASP）轉(zhuǎn)錄，加劇動脈粥樣硬化。這一機制揭示了細胞代謝與表觀遺傳調(diào)控之間的相互作用，為TRAP1作為潛在治療靶點提供了依據(jù)。
TRAP1的作用：TRAP1是線粒體功能的重要調(diào)節(jié)因子，其基因敲除小鼠在與年齡相關(guān)的疾病中表現(xiàn)出的發(fā)病率降低。此研究中，TRAP1在衰老VSMC中的過表達導(dǎo)致糖酵解上調(diào)，從而影響能量代謝。
組蛋白乳酸化的作用：組蛋白乳酸化在多種生物過程中發(fā)揮重要作用，并在與衰老相關(guān)的SASP激活中起關(guān)鍵角色。本研究強調(diào)H4K12la在衰老特異性染色質(zhì)微環(huán)境的構(gòu)建中的作用。
HDAC3作為關(guān)鍵因子：HDAC3被確定為調(diào)節(jié)H4K12la的重要酶，它的抑制導(dǎo)致H4K12la水平升高，SASP增強，進而促進VSMC衰老，為動脈粥樣硬化的治療提供了新的靶點。
代謝與表觀遺傳學(xué)的交互：研究揭示了乳酸代謝與組蛋白修飾之間的新聯(lián)系，表明代謝信號在衰老和動脈粥樣硬化中的重要性，提出代謝-表觀遺傳串擾的觀點，并引出對其他代謝中間體的研究。
細胞衰老對健康的影響：細胞衰老與多種疾病密切相關(guān)，包括心血管疾病，線粒體功能損傷和代謝異常在細胞衰老中起核心作用。本研究指出：
（1）衰老的VSMC中糖酵解水平升高，推動進一步探索細胞代謝重編程的機制；
（2）研究還指出腫瘤藥物（如他莫昔芬和TRAP1抑制劑G-TPP）在動脈粥樣硬化治療中的潛在應(yīng)用，強調(diào)了重新利用抗腫瘤藥物來應(yīng)對衰老驅(qū)動的心血管疾病的可能性；
（3）PROTAC BP3作為新型藥物，能夠高效誘導(dǎo)TRAP1降解，顯示出治療動脈粥樣硬化的潛力，并具備較高的選擇性和較低的細胞毒性。
局限性與未來研究方向：盡管乳酸對HDAC3的抑制影響明顯，但其具體機制仍需進一步研究，未來在細胞代謝與表觀遺傳學(xué)交互方面的研究仍有廣闊空間。
參考文獻：
[1] Li X, et al. TRAP1 drives smooth muscle cell senescence and promotes atherosclerosis via HDAC3-primed histone H4 lysine 12 lactylation. Eur Heart J. 2024 Aug.
doi:10.1093/eurheartj/ehae379
聯(lián)系人：張
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